共聚焦显微镜与普通光学显微镜的对比

共聚焦显微镜与普通光学显微镜的对比

显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜同属于光学显微镜。

一、普通光学显微镜

普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便。

显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关，分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为：

R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2

式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。

制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。

普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。

二、激光共聚焦扫描显微境

激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope），用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

为什么需要共聚焦显微镜?

1.光学显微镜经过了我们伟大的前人们的努力与改良，已经臻于完善的地步。事实上，通常的显微镜可以简单、快捷地为我们提供美丽的微观图像。但是，给这个近乎完善的显微镜世界带来革命性创新的事件发生了，这就是“激光扫描型共聚焦显微镜”的发明。这种新型显微镜的特点是：采用仅将焦点所集中的面上的图像情报提取出来的光学系统，通过改变焦点的同时将所获得的信息在图像存储器内复原，从而可以获得具有完全3维信息情报的鲜明的图像。通过这个方法，可以简单地获得以通常的显微镜所无法确认的、关于表面形状的信息。另外，对于通常的光学显微镜来说，“提高分辨率”与“加深焦点深度”是相互矛盾的条件，尤其在高倍率时这个矛盾更为突出，但在共聚焦显微镜来讲，这个难题迎刃而解。

2.共聚焦光学系统的优势

激光共焦显微镜原理图

共聚焦光学系统是对样品进行点照明，同时反射光也采用点感受器来受光。样品被放置在焦点位置时，反射光几乎全部可以到达感光器，样品偏离焦点时，反射光无法到达感光器。也就是说，共聚焦光学系统中，只有与焦点重合的图象会被输出，光斑、无用的散乱光都被屏蔽掉了。

3.为何用激光？

共聚焦光学系统中，对样品进行点照明、同时反射光亦采用点感光器受光。因此，点光源就成为必要。激光属于非常优秀的点光源。大多数情况下，共聚焦显微镜的光源都采用激光光源。另外，激光所具有的单色性、方向性以及优异的光束形状等特征，也是被广泛采用的重要理由。

4.高速扫描基础上的实时观察成为可能

激光的扫描，其水平方向采用了声控光学偏向单元（Acoustic Optical Deflector，AO素子）、垂直方向采用了伺服电控光束扫描镜（Servo Galvano-mirror）。音响光学偏向单元由于不存在机械性震动部分，所以可以进行高速的扫描，在监视画面上实时观察成为可能。这种摄像的高速性，是直接影响聚焦、位置检索速度的非常重要的项目。

5.焦点位置和亮度的关系

共聚焦光学系统中，样品被正确地放置在焦点位置时亮度为最大，在它的前后，其亮度皆会锐减（图4实线）。这种焦点面的敏感的选择性，也正是共聚焦显微镜高度方向测定以及焦点深度扩张的原理所在。相对于此，通常的光学显微镜则在焦点位置前后不会有明显的亮度变化（图4点线）。

6.高对比度、高分辨率

通常的光学显微镜，由于偏离焦点部分的反射光会发生干扰，它与焦点成像部分发生重叠，从而造成图像对比度的降低。而相对于此，共聚焦光学系统中，焦点以外的散乱光以及物镜内部的散乱光几乎完全被去除掉，因而可以获得对比度非常高的图像。另外，由于光线2次通过物镜使得点像更加先锐化，也提高了显微镜的分辨能力。

7.光学局部化功能

共聚焦光学系统中，与焦点重合点以外的部分的反射光被微孔屏蔽掉了。因此在观察立体样品时，形成如同用焦点面对样品进行切片后形成的图象（图5）。这种效果被称为光学局部化，属于共聚焦光学系统的特长之一。

8.焦点移动记忆机能

所谓焦点以外的反射光被微孔屏蔽掉，反过来看的话，可以认为共聚焦光学系统所成的像上所有的点均与焦点重合。因此将立体样品沿Z轴（光轴）方向移动的话，将图像累积保存在存储器内，最终就会获得样品全体与焦点重合而形成的图像。以这种方法将焦点深度无限加深的机能称做移动记忆机能。

9.表面形状测定机能

焦点移动机能上，追加以面的高度记录回路，就可以对样品的表面形状进行非接触式测定。以此机能为基础，对各画素中最大辉度值形成的Z轴坐标的记录成为可能，并以此情报为依据可以获得样品表面形状相关的情报。

10.高精度微小尺寸测定机能

受光单元采用了1维CCD成像传感器，因此可以不受扫描装置扫描倾斜等的影响，从而可以完成高精度的测定。另外，由于同时采用焦点深度可调（加深）的焦点移动记忆机能，从而可以剔除由于焦点偏移而造成的测定误差。

11.三维图像解析

使用表面形状测定机能，可以轻松地做出样品表面三维图像。不仅如此，还可以进行多种解析如：表面粗糙度测定、面积、体积、表面积、圆形度、半径、绝对最大长度、周长、重心、断层图像、FFT变换、线幅测定等等。

激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。